|
Схема фракционирования плацентарной сыворотки
Схема фракционирования плацентарной сыворотки по варианту Б
Сыворотка |
Предварительная
очистка |
Спирт — 8%-ный pH 7,3 t — 3° |
Осадок (выбрасывают) |
Центрифугат |
Первое осаждение |
Спирт — 26%-ный pH 7,2—7,3 t — 6—6° |
Центрифугат в основном альбумин, гамма-глобулин, часть бета-глобулина |
Осадок глобулинов растворяют |
Повторное первое осаждение |
Спитр — 26%-ный
pH 7,0
и.с. — 0,075, t — 5—6° |
Центрифугат остатки альбумина |
Осадок глобулинов растворяют |
Второе осаждение |
Спирт — 13% -ный pH 5,0—5.05
и. с. — 0,02, t — 3° |
Осадок в основном бета-глобулни, часть альфа- и гамма-глобулинов |
Центрифугат |
Третье осаждение |
Спирт — 26% -ный pH 7,0—7,2 и.с. — 0,05,
t — 5° |
На дополнительное извлечение гамма -глобулина |
Осадок |
Гамма-глобулин на растворение и стерилизующую фильтрацию |
Растворение |
Спирт — 13%-ный pH 5,0 t — 3° |
Осадок бета-глобулина и липоиды |
Центрифугат |
Спирт — 26%-ный pH 7,0-7,2 и.с. 0,05 t — 5° |
Гамма-глобулин на переосаждение |
Осадок |
Гамма-глобулин после переосаждения на растворение и стерилизующую фильтрацию |
Однако, несмотря на ряд внесенных дополнений, метод осаждения спиртом на холоду остается сложным и имеет ряд существенных недостатков, важнейшими из которых являются: многостадийность процесса разделения белков, узкость интервалов физико-химических констант, при которых производится фракционирование, сравнительно высокие потери белков в процессе производства и необходимость проведения всего процесса фракционирования при низких температурах.
В 1952 г. L. Horejsi впервые применил риванол (2- этокси- 6,9-диаминоакридин лактат) для фракционирования белков сыворотки крови и установил, что при добавлении водно-риванолового раствора к сыворотке осаждается альбумин и большая часть бета- и альфа-глобулинов, а в фильтрате остается гамма-глобулин. В дальнейшем этот же автор совместно с P. Smetana (1954; 1956) разработал условия осаждения, обеспечивающие более высокую очистку препарата. Удалось установить, что наилучшие результаты имеют место при 0,4%-ной концентрации водно-риванолового раствора и 3,5-кратном объеме его в объеме сыворотки. Риванол удаляется из жидкости адсорбцией активированным углем (10 г норита на 100 мл). После фильтрации раствор гамма-глобулина высушивается. Выход препарата при этом не уступает методу с использованием спиртового осаждения на холоду. Позже О. С. Циперович и И. Т. Галич (1963), а затем Н. Г. Турлянцева (1966) модифицировали его. Было предложено получать осадок из фильтрата не с помощью высушивания, а путем осаждения его 30%-ным раствором сернокислого аммония с последующим диализом.
Однако риваноловый метод также не лишен недостатков. Прежде всего они выражаются в большом разведении сыворотки раствором риванола, что затрудняет получение гамма-глобулина. Кроме того, изготовленный препарат содержит следы бета- и альфа-глобулинов.
К. Ноева (1959) получала гамма-глобулин из плацентарной сыворотки с помощью риванол-спиртового метода. Соотношение сыворотки к риванолу равнялось 1:3, концентрация последнего была 0,4%. Количество активированного угля — 6 г/л смеси. Гамма-глобулин из фильтрата получала путем осаждения 96%-ным спиртом при pH 7,0 с понижением температуры до —5° и до 26%-ной концентрации спирта в растворе. Чистота гамма-глобулина по электрофорезу была равна 97%. Т. Г. Губенко (1960, 1961) предложила модифицированный риванол-спиртовый метод. Видоизменения состоят в том, что риванол из раствора удаляется не активированным углем, а хлористым натрием в 0,85%-ной концентрации. При этом был получен чистый гамма-глобулин без примеси посторонних фракций.
Заслуживает упоминания и метод спиртоферм, разработанный Н. А. Пономаревой, А. С. Нечаевой (1965), применительно к антитоксическим сывороткам, но который может быть также использован для получения гамма-глобулина из противовирусных сывороток. Общие глобулины осаждаются из сыворотки при pH 6,5, концентрации спирта 40% и температуре —5°. Затем их растворяют в дистиллированной воде до первоначального объема раствора. Ферментацию белкового раствора производят пепсином при температуре 27—28°, 1,5 часа при pH 3,2 и столько же при pH 4,2, после чего раствор охлаждается до 0° и после установления pH 6,5 добавляется 96%-ный спирт до 8%-ной концентрации в смеси. Выпавший балластный осадок удаляется центрифугированием. Из фильтрата выделяется гамма-глобулин осаждением спиртом до 25%-ной концентрации смеси, при pH 7,0 и температуре —5°.
Б. А. Васильев (1965) разработал метод очистки белков сыворотки риванолом с последующим пептическим гидролизом и концентрированием ацетоном. Для дополнительной очистки препарата от балластных белков автор рекомендует использовать гидрат окиси алюминия.
Анализируя приведенные по методам фракционирования белков сыворотки крови человека и животных, видно, что наибольшее практическое применение получили методы с использованием нейтральных солей и спиртово-водных осадителей. На протяжении длительного времени методы фракционирования совершенствовались. Доказательством чего может быть использование с этой целью акридиновых оснований. Однако все же существующие методы имеют ряд недостатков, о которых было указано выше. Поэтому любые попытки, направленные на дальнейшее совершенствование очистки сывороточных иммунных глобулинов, являются весьма важными. 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
116
117
118
119
120
121
122
123
124
125
126
127
128
129
130
131
132
133
134
135
136
137
138
139
140
141
142
143
144
145
146
147
148
149
150
151
152
153
154
155
156
157
158
159
160
161
162
163
164
165
166
167
168
169
170
171
172
173
174
175
176
177
178
179
180
181
182
183
184
185
186
187
188
189
190
191
192
193
194
195
196
197
198
199
200
201
202
|