Исследования в области особоопасных инфекций

Схема фракционирования плацентарной сыворотки

Схема фракционирования плацентарной сыворотки по варианту Б

Сыворотка
Предварительная
очистка
Спирт — 8%-ный pH 7,3 t — 3° Осадок (выбрасывают)
Центрифугат
Первое осаждение Спирт — 26%-ный pH 7,2—7,3 t — 6—6° Центрифугат в основном альбумин, гамма-глобулин, часть бета-глобулина
Осадок глобулинов растворяют
Повторное первое осаждение Спитр — 26%-ный
pH 7,0
и.с. — 0,075, t — 5—6°
Центрифугат остатки альбумина
Осадок глобулинов растворяют
Второе осаждение Спирт — 13% -ный pH 5,0—5.05
и. с. — 0,02, t — 3°
Осадок в основном бета-глобулни, часть альфа- и гамма-глобулинов
Центрифугат
Третье осаждение

Спирт — 26% -ный pH 7,0—7,2 и.с. — 0,05,

t — 5°

На дополнительное извлечение гамма -глобулина
Осадок
Гамма-глобулин на растворение и стерилизующую фильтрацию Растворение
Спирт — 13%-ный pH 5,0 t — 3° Осадок бета-глобулина и липоиды
Центрифугат
Спирт — 26%-ный pH 7,0-7,2 и.с. 0,05 t — 5° Гамма-глобулин на переосаждение
Осадок
Гамма-глобулин после переосаждения на растворение и стерилизующую фильтрацию

Однако, несмотря на ряд внесенных дополнений, метод осаждения спиртом на холоду остается сложным и имеет ряд существенных недостатков, важнейшими из которых являются: многостадийность процесса разделения белков, узкость интервалов физико-химических констант, при которых производится фракционирование, сравнительно высокие потери белков в процессе производства и необходимость проведения всего процесса фракционирования при низких температурах.

В 1952 г. L. Horejsi впервые применил риванол (2- этокси- 6,9-диаминоакридин лактат) для фракционирования белков сыворотки крови и установил, что при добавлении водно-риванолового раствора к сыворотке осаждается альбумин и большая часть бета- и альфа-глобулинов, а в фильтрате остается гамма-глобулин. В дальнейшем этот же автор совместно с P. Smetana (1954; 1956) разработал условия осаждения, обеспечивающие более высокую очистку препарата. Удалось установить, что наилучшие результаты имеют место при 0,4%-ной концентрации водно-риванолового раствора и 3,5-кратном объеме его в объеме сыворотки. Риванол удаляется из жидкости адсорбцией активированным углем (10 г норита на 100 мл). После фильтрации раствор гамма-глобулина высушивается. Выход препарата при этом не уступает методу с использованием спиртового осаждения на холоду. Позже О. С. Циперович и И. Т. Галич (1963), а затем Н. Г. Турлянцева (1966) модифицировали его. Было предложено получать осадок из фильтрата не с помощью высушивания, а путем осаждения его 30%-ным раствором сернокислого аммония с последующим диализом.

Однако риваноловый метод также не лишен недостатков. Прежде всего они выражаются в большом разведении сыворотки раствором риванола, что затрудняет получение гамма-глобулина. Кроме того, изготовленный препарат содержит следы бета- и альфа-глобулинов.

К. Ноева (1959) получала гамма-глобулин из плацентарной сыворотки с помощью риванол-спиртового метода. Соотношение сыворотки к риванолу равнялось 1:3, концентрация последнего была 0,4%. Количество активированного угля — 6 г/л смеси. Гамма-глобулин из фильтрата получала путем осаждения 96%-ным спиртом при pH 7,0 с понижением температуры до —5° и до 26%-ной концентрации спирта в растворе. Чистота гамма-глобулина по электрофорезу была равна 97%. Т. Г. Губенко (1960, 1961) предложила модифицированный риванол-спиртовый метод. Видоизменения состоят в том, что риванол из раствора удаляется не активированным углем, а хлористым натрием в 0,85%-ной концентрации. При этом был получен чистый гамма-глобулин без примеси посторонних фракций.

Заслуживает упоминания и метод спиртоферм, разработанный Н. А. Пономаревой, А. С. Нечаевой (1965), применительно к антитоксическим сывороткам, но который может быть также использован для получения гамма-глобулина из противовирусных сывороток. Общие глобулины осаждаются из сыворотки при pH 6,5, концентрации спирта 40% и температуре —5°. Затем их растворяют в дистиллированной воде до первоначального объема раствора. Ферментацию белкового раствора производят пепсином при температуре 27—28°, 1,5 часа при pH 3,2 и столько же при pH 4,2, после чего раствор охлаждается до 0° и после установления pH 6,5 добавляется 96%-ный спирт до 8%-ной концентрации в смеси. Выпавший балластный осадок удаляется центрифугированием. Из фильтрата выделяется гамма-глобулин осаждением спиртом до 25%-ной концентрации смеси, при pH 7,0 и температуре —5°.

Б. А. Васильев (1965) разработал метод очистки белков сыворотки риванолом с последующим пептическим гидролизом и концентрированием ацетоном. Для дополнительной очистки препарата от балластных белков автор рекомендует использовать гидрат окиси алюминия.

Анализируя приведенные по методам фракционирования белков сыворотки крови человека и животных, видно, что наибольшее практическое применение получили методы с использованием нейтральных солей и спиртово-водных осадителей. На протяжении длительного времени методы фракционирования совершенствовались. Доказательством чего может быть использование с этой целью акридиновых оснований. Однако все же существующие методы имеют ряд недостатков, о которых было указано выше. Поэтому любые попытки, направленные на дальнейшее совершенствование очистки сывороточных иммунных глобулинов, являются весьма важными.

1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  15  16  17  18  19  20  21  22  23  24  25  26  27  28  29  30  31  32  33  34  35  36  37  38  39  40  41  42  43  44  45  46  47  48  49  50  51  52  53  54  55  56  57  58  59  60  61  62  63  64  65  66  67  68  69  70  71  72  73  74  75  76  77  78  79  80  81  82  83  84  85  86  87  88  89  90  91  92  93  94  95  96  97  98  99  100  101  102  103  104  105  106  107  108  109  110  111  112  113  114  115  116  117  118  119  120  121  122  123  124  125  126  127  128  129  130  131  132  133  134  135  136  137  138  139  140  141  142  143  144  145  146  147  148  149  150  151  152  153  154  155  156  157  158  159  160  161  162  163  164  165  166  167  168  169  170  171  172  173  174  175  176  177  178  179  180  181  182  183  184  185  186  187  188  189  190  191  192  193  194  195  196  197  198  199  200  201  202