Исследования в области особоопасных инфекций

Современные методы очистки и концентрации антитоксических сывороток

История очистки и концентрации при помощи протеолитических ферментов начинается с 1898 г., когда F. Umber была отмечена устойчивость глобулинов сыворотки к действию пепсина.

В этом же году S. Belfanti, Т. Carbone с целью очистки сыворотки от балластных белков использовали пепсин. Они установили, что при воздействии фермента одновременно разрушаются балластные белки и антитоксины, что связано, как показал С. К. Дзержговокий (1899), с кислой реакцией среды.

В 1902 г. R. Proscher применил для очистки противодифтерийной сыворотки трипсин, К. Imrag (1903) — трипсин и пепсин.

Опыты этого периода с ферментолизом сывороток до 1936 г. не вышли, по существу, из рамок лабораторных исследований из-за низкого выхода антитоксина.

В 1936 г. в патентной литературе США был описан патент, выданный I. Parfentjev на очистку антитоксических сывороток путем расщепления пепсином.

Автор установил, что в слабокислой среде (pH 4,0) пепсин не разрушает антитоксина, но переваривает альбумины и денатурирует эвглобулилы, которые удаляются в процессе технологии. Н. Schullze (1940), Е. Cohn с соавт., (1944), A. Harms (1948) своими исследованиями подтвердили большую устойчивость иммунных псевдоглобулинов к гидролизующему действию пепсина. При этом было показано, что антитоксин бета-фракции противодифтерийных сывороток более устойчив, чем гамма-фракции, особенно на первых циклах эксплуатации лошадей (В. Н. Мирскова с соавт., 1965). Метод I. Parfentjev (1936) получил производственное признание сначала в США, а затем в других странах. Способ включает в себя 3 основных этапа: протеолиз, термоденатурацию и осаждение сульфатом аммония с последующим удалением соли диализом. После опубликования патента И. Парфентьева появилось огромное количество работ, посвященных ферментативному гидролизу белков. Условия ферментолиза антитоксина и теоретическое обоснование были подробно изложены в фундаментальных работах С. Pope (1938, 1939), C. Pope, М. Healey (1939). Описываются различные варианты ферментативного гидролиза G. Sandor, R. Rechon (1939): G. Sandor (1939); F. Modern, G. Kuff (1938, 1940); M. Peter- mann (1942); С. М. Сосиной (1942, 1947); А. Д. Адо (1943); A. Hansen (1948); G. Amoureus (1951); M. Gacobs (1953); I. Delasel, H. Chamsy (1953); C. Anderson (1955); F. Geu, D. Pavageau (1956); R. Porter (1959); A. Nisonoff. D. Wolenby (1959) и другими.

Было показано (С. Pope, 1938, 1939), что при ферментативном гидролизе молекула антитоксина расщепляется на 2 части, одна из них обладает антитоксической активностью и является более термостабильной, а другая — неактивная в присутствии сернокислого аммония, при нагревании легко денатурируется. Аналогичные данные приводят М. Petermann, A. Pappenheimer (1941). Оказалось, что активная, изменившаяся под действием пепсина часть псевдоглобулина представляет собой половину и четверть его нативной молекулы, эвглобулин же расщепляется в небольшом количестве. Было показано, что на скорость и полноту переваривания сывороточных белков пепсином влияет в основном реакция среды (F. Modern, G. Ruff, 1938, 1940).

Исследования по ферментации белков иммунной сыворотки и препаративному их разделению в 40—50-х годах XX в. увенчались разработкой различных технологических схем очистки и концентрации гетерогенных сывороток. На некоторых из них мы остановимся ниже. Следует лишь указать, что они имеют свои особенности, как-то: по длительности ферментации белка, температуре термокоагуляции, способам удаления балластных белков и т. д.

Так, по методу I. Parfentjev (1936) протеолиз белков проводится при pH 4,0—4,5 в течение нескольких часов при 37°, селективное разделение белков осуществляется сернокислым аммонием; осадок содержащий антитоксин, диализуют и обрабатывают свежеприготовленным фосфатом кальция.

По С. Pope (1939), ферментация практически заканчивается при разведении сыворотки до 3% белка, pH 3,2 и 32° в течение 30 минут, что существенно ускоряет процесс протеолиза. По методу A. Hansen (1948), в очистку и концентрацию бралась кровь. Широко используя сорбенты — бентонит и гидроокись алюминия, автор отказался от этапа термоденатурации. Для концентрации антитоксина им применялось высаливание белков.

1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  15  16  17  18  19  20  21  22  23  24  25  26  27  28  29  30  31  32  33  34  35  36  37  38  39  40  41  42  43  44  45  46  47  48  49  50  51  52  53  54  55  56  57  58  59  60  61  62  63  64  65  66  67  68  69  70  71  72  73  74  75  76  77  78  79  80  81  82  83  84  85  86  87  88  89  90  91  92  93  94  95  96  97  98  99  100  101  102  103  104  105  106  107  108  109  110  111  112  113  114  115  116  117  118  119  120  121  122  123  124  125  126  127  128  129  130  131  132  133  134  135  136  137  138  139  140  141  142  143  144  145  146  147  148  149  150  151  152  153  154  155  156  157  158  159  160  161  162  163  164  165  166  167  168  169  170  171  172  173  174  175  176  177  178  179  180  181  182  183  184  185  186  187  188  189  190  191  192  193  194  195  196  197  198  199  200  201  202