|
Получение высокоактивных токсинов для производства ботулинических антигенов
Как указывает Т. И, Булатова с соавт. (1970), при сравнительном культивировании штамма F 470 на бульонах казеиново-грибном, казеиново-кислотном, а также из кислотного гидролизата рыбо-костной муки сила токсина на последнем бульоне была наибольшей — 80—100 тыс. Dlm/мл.
Таким образом, из большого числа питательных сред, применяемых для производства ботулинических антигенов, наибольшее распространение получили для культивирования типов А и В бульон Глузмана, типов Е и F — бульон Мартена, типа С — кислотно-казеиновая среда с кукурузным экстрактом, для типа Д — бульон Вейнберга.
Для получения высокоактивных токсинов большое значение имеют условия культивирования, как-то: температура, процент посевного материала, длительность культивирования и т. д.
Многими авторами (К. И. Матвеев, Т. И. Булатова, 1948; А. А. Воробьев, Н. Н. Васильев, А. Т. Кравченко, 1965; Л. Г. Щипкова, 1973; В. И. Чернявский, 1973) отмечается в первые 2—3 дня быстрое размножение Cl. botulinum. В этот период токсина в среде мало, на 3—4-е сутки наступает постепенная задержка размножения, а затем на 5—6-е сутки происходит лизис бактерий, культура начинает просветляться. В этот период быстро повышается в среде количество токсина.
A. Prevot, Е. Brygoo (1953) отмечают, что ботулинические токсины типов А и В в процессе роста быстро диффундируют в окружающую среду через клеточную оболочку, токсины типов С и Д более долгое время задерживаются в клетке. Ток
син типа Е занимает промежуточное положение: он не задерживается в бактериальной клетке и не очень быстро появляется в среде. Это в какой-то мере определяет длительность культивирования микробов.
Cl. botulinum типов А, В, С культивируют при 34—35° в течение 5—7 суток (С. А. Зелевинская, 3. М. Волкова, 1935;. Г. А. Королева К. И. Матвеев, 3. М. Волкова, 1958; К, И Матвеев, Т. И. Булатова, 1959; А. П. Маркин, Е. П. Лукин, Е. К. Петрова, А. А. Воробьев, 1961 и др.), типа Е — при температуре 28° в течение 7—11 суток (А. А. Воробьев, Н. Н. Васильев, Л. М. Самородов, И. В. Воронцов, Г. Т. Патрикеев, М. М. Макаренко, 1962; Е. Райчева и Н Марчев, 1966; Н. Марчев, 1967; Ю. А. Шаронов, Р. А. Афанасьева, 1968; В. И. Чернявский, 1973; С. А. Соловьева, 1973 и др.). По Е. Д. Кушнир (1941, 1952), наиболее подходящей температурой для выращивания Cl. botulinum типа Е является 22—25°. Г. А. Королева, К. И. Матвеев, 3. М. Волкова (1958) культивировали тип Е при 26°.
Культивирование Cl. botulinum типа F И. М. Михайлова и В. К. Гольшмид (1966) проводили при 28° 7 суток.
Накопление токсина связано с pH среды. 3. М. Волкова и А. К. Данкеровиц (1935) показали, что pH при культивировании ботулимических бацилл падает в первые сутки с 7,8 до 6,6 и держится на этом уровне до 9-го дня, а затем начинает повышаться. Авторы полагают, что наименьшее pH в процессе роста возбудителей ботулизма является показателем максимума токсинообразования. По наблюдениям 3. Ф. Зубовой (1950), по мере роста бацилл типа А и В исходный pH питательной среды к 3—5-м суткам снижался и возрастал к 8—9-м. Максимум токсинообразования наблюдался в большинстве случаев на 7-й день. Культивирование Cl. botulinum типа F также приводит к снижению величины pH с 7,8 до 7,1 (В. П. Царапкин, 1972).
Е. Д. Кушнир (1952) указывает, что для токсинообразования С1. botulinum типа Е лучше применять среды, имеющие pH 7,4—7,8. При pH 6,5 и 6,8 токсинообразование заметно снижается, а при pH 6,0 прекращается. Добавление к питательной среде углекислого кальция способствует стабилизации pH. Аналогичные результаты приводят С. Г. Атаманова и Е. Н. Воробьева (1969). Изучение динамики pH, проведенное С. А. Соловьевой (1973), показало, что при культивировании штамма Cl. botulinum типа Е 341 на бульоне Мартена наблюдается резкое подкисление среды на 3-и сутки. Дальнейшее снижение реакции среды менее значительно и продолжается до 11 суток, что соответствует максимуму токсинообразования. Затем pH стабилизируется и остается на одном уровне до 15 суток (период наблюдения). 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
116
117
118
119
120
121
122
123
124
125
126
127
128
129
130
131
132
133
134
135
136
137
138
139
140
141
142
143
144
145
146
147
148
149
150
151
152
153
154
155
156
157
158
159
160
161
162
163
164
165
166
167
168
169
170
171
172
173
174
175
176
177
178
179
180
181
182
183
184
185
186
187
188
189
190
191
192
193
194
195
196
197
198
199
200
201
202
|