Исследования в области особоопасных инфекций

Схема фракционного осаждения сернокислым аммонием

Варьируя условия осаждения глобулинов сернокислым аммонием и используя феномен избирательной растворимости отдельных компонентов плазмы в растворах хлористого натрия, R. Gibson (1906) создал метод очистки антитоксина, который нашел применение в практике. Схема очистки этого метода включала высаливание всех глобулинов при полунасыщении сернокислым аммонием, экстракцию осадка глобулинов насыщенным раствором хлористого натрия (при этом эвглобулины остаются в осадке) и повторное осаждение антитоксического псевдоглобулина сернокислым аммонием.

Радикальным изменением в очистке антитоксинов этим методом явилось введение прогревания материала. Используя неадекватную термолабильность белковых компонентов, Е. Banzhof, R. Gibson (1907) разработали метод, который включал не только преципитацию антитоксина сульфатом аммония, но и термокоагуляцию термолабильных протеинов. Это увеличило количество белков в эвглобулиновой фракции и повысило тем самым степень очистки сывороток.

Почти одновременно с ними была предложена схема очистки и концентрации русскими авторами К. С. Дзержговским и С. Н. Предтеченским (1908), которые впервые подробно описали технологический процесс и оригинальную аппаратуру. Их метод основан на фракционном высаливании иммунного глобулина полунасыщенным раствором сернокислого аммония с последующим отжатием получаемого осадка псевдоглобулина под прессом и его диализом. Удаление эвглобулинов по способу R. Gibson было более сложным, чем по методу К. С. Дзержговского и С. Н. Предтеченского, поэтому в США также перешли на метод русских авторов, дополнив его прогреванием сывороток по Е. Banzhof.

Этот метод, вошедший в историю под названием метода Банцгофа-Дзержговского (метода водного диализа или фракционного осаждения сернокислым аммонием), в течение многих лет был единственным способом очистки и концентрации антитоксических сывороток как в США, так и в нашей стране. Разделение белков сыворотки и плазмы высаливанием сернокислым аммонием проводили в дальнейшем многие авторы (А. В. Маркович, И. М. Хаустова, 1939, 1943; Е. Cohn с соавт., 1949; Н. Svensson, 1941; А. И. Михайлов, 1942; В. И. Вашков и Н. А. Курочкина, 1946 и др.).

А. В. Маркович и И. М. Хаустова (1938, 1939, 1943) усовершенствовали метод Банцгофа-Дзержговского. Они провели ряд исследований, направленных на повышение степени очистки антитоксина от балластных белков путем отработки условий термоденатурирующего прогрева сыворотки, степени разведения ее, способа добавления сернокислого аммония.

Схема метода фракционного осаждения сернокислым аммонием (Банцгофа — Дзержговского)
Разведение сыворотки (1 v) дистиллированной водой (0,5v)
Высаливание эйглобулинов
а) насыщение сыворотки 29,5—30% сернокислого аммония
б) прогревание от 58 до 60° 1 ч и при 60° — 15 мин
Осадок эйглобулина отбрасывают - Из фильтрата высаливается псевдо-глобулин добавлением (NH4)2SO4 до 48%-ного насыщения
Фильтрат отбрасывают - Осадок псевдоглобулина прессуется
Диализ до содержания 0,02—0,03% (NH4)2SO4
Стандартизация до 0,85% NaCl и pH 7,3—7,4
Стерилизующая фильтрация

В результате обработки сыворотки методом фракционного осаждения сернокислым аммонием титр антитоксина возрастает в 2—3 раза по сравнению с титром исходных нативных сывороток, очистка от балластных белков достигает не менее 50%, отходы антитоксина составляют 20—40%.

Использование термической обработки увеличивает степень очистки, однако при этом возрастают и потери антитоксина.

Следует отметить, что на величину потери при очистке и концентрации оказывают влияние длительность диализа (В. Н. Мирскова, Г. В. Альгина, 1945), а также хранение сывороток (А. В. Маркович, 1937; А. И. Михайлов, 1942; В. И. Вашков, Н. А. Курочкина, 1943). По данным В. И. Башкова и Н. А. Курочкиной (1943), сыворотки, имеющие возраст от 2 До 3 лет, дают потери от 26 до 38%, при хранении от 1 года до 2 лет — 14,3—25,5%, при хранении от 3 месяцев до 1 года — 5—12,3%. А. И. Михайлов (1942) объясняет это тем, что в старых сыворотках при удалении эвглобулинов во время концентрирования выпадает часть псевдоглобулинов, вследствие чего наблюдается до 70% потерь антитоксина. Те же сыворотки, концентрированные вскоре после их получения от продуцентов, давали потери до 20% антитоксина.

1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  15  16  17  18  19  20  21  22  23  24  25  26  27  28  29  30  31  32  33  34  35  36  37  38  39  40  41  42  43  44  45  46  47  48  49  50  51  52  53  54  55  56  57  58  59  60  61  62  63  64  65  66  67  68  69  70  71  72  73  74  75  76  77  78  79  80  81  82  83  84  85  86  87  88  89  90  91  92  93  94  95  96  97  98  99  100  101  102  103  104  105  106  107  108  109  110  111  112  113  114  115  116  117  118  119  120  121  122  123  124  125  126  127  128  129  130  131  132  133  134  135  136  137  138  139  140  141  142  143  144  145  146  147  148  149  150  151  152  153  154  155  156  157  158  159  160  161  162  163  164  165  166  167  168  169  170  171  172  173  174  175  176  177  178  179  180  181  182  183  184  185  186  187  188  189  190  191  192  193  194  195  196  197  198  199  200  201  202