Метод Диаферм-3
A. Harms (1948) указывает на преимущество работы с плазмой по сравнению с цельной кровью, сывороткой или с высоленными фракциями плазмы. По его схеме ферментация проводится при разведенной плазме 1:3 в течение 30 минут при pH 3,2 и температуре 30°, тепловая денатурация — при 55° в присутствии сернокислого аммония и трикрезола.
По G. Amoureux, F. Уеих (1951), фракция сыворотки разводится 1:1 и ферментируется при 31,5° и реакции среды 3,2 в течение 30 минут, термокоагуляция осуществляется при 55—57° в присутствии 14% сернокислого аммония и раствора толуола.
В 1953 г. в институте Пастера видоизменили схему и предложили сыворотку разводить в 2,33 раза, ферментацию проводить при pH 3,1—3,2 в течение 1 часа, термокоагуляцию — при 58° в течение 45 минут.
В Советском Союзе ферментацию белков сыворотки с целью очистки и концентрации впервые применила С. М. Сосина (1942). Она предложила ее как дополнительную очистку к солевому методу.
А. Д. Адо (1943) использовал для переваривания белков антитоксической сыворотки поджелудочный сок собаки. Он показал, что ферментолиз повышает удельную активность препарата.
В 1943 г. А. В. Маркович и И. М. Хаустова отметили, что пепсин в больших дозах оказывает защитное действие в кислой среде на антитоксин противодифтерийной сыворотки.
Следует отметить, что в период Великой Отечественной войны и первые послевоенные годы антитоксические сыворотки в Советском Союзе выпускались в нативном и очищенном методами фракционирования нейтральными солями виде.
Технологическую схему очистки и концентрации антитоксических сывороток с помощью ферментолиза создал авторский коллектив во главе с А. В. Бейлинсон (1954). Были предложены последовательно 3 схемы очистки антитоксических сывороток, включающих ферментолиз, термоденатурацию балластных белков и диализ — Диаферм. Последняя модификация метода Диаферм-3 ИЭМ АМН СССР широко применяется во всех сывороточных производствах нашей страны. При очистке этим методом ферментация белков сыворотки ведется 2 часа при температуре 23° и pH среды 3,2 и 4,2 высокоактивным ферментом.
Балластные вещества удаляются с осадком при pH 4,3 прогреванием ферментированных сывороток 45 минут при 58° в присутствии 14%-сернокислого аммония.
Ферментированный иммунный глобулин выделяется из фильтрата при pH 7,0—7,1 дополнительным высаливанием сернокислым аммонием из расчета 200 г на 1 л фильтрата. Выпавший при этих условиях осадок иммунного глобулина отфильтровывается, прессуется и подвергается диализу проточной водопроводной водой.
Для последующей очистки ферментированных белков в сыворотку добавляют хлороформ и соляную кислоту до pH 5,0—5,3.
Еще в 1945 г. А. В. Бейлинсон с соавт. отметила, чго сыворотки, полученные после обработки пепсином, отличаются значительной вязкостью. Для освобождения от последней авторы применили изоэлектрическое осаждение денатурированных продуктов протеолиза при наличии в среде тонко эмульгированного хлороформа. Добавление в сыворотку после диализа 30% по объему хлороформа и энергичное встряхивание приводит в процессе осторожного и медленного подкисления к получению стабильной эмульсии хлороформа с желатинированными частицами белка, загрязняющего концентрированную сыворотку и сообщающего ей повышенную вязкость. После стояния на холоде эмульсия хлороформа в сыворотке разрушается, а желатинированные белки продолжают прочно удерживать хлороформ, погружаясь вместе с ним на дно, где образуют плотный осадок. Дополнительная очистка демонстративно видна на фореграммах. В сыворотке после диализа содержится 3 фракции белков, находящихся в зоне гамма-, бета-, и альфа-глобулинов. Дополнительная обработка ее хлороформом с последующим изоосаждением при вышеуказанном pH ведет к исчезновению фракции, лежащей в зоне альфа-глобулина, при этом оседает до 65% из противостолбнячной, до 50% — из противодифтерийной сывороток липопротеидов (А. И. Михайлов, с соавт., 1958).
На наличие 3 фракций в пептолизатах указывают также И. Я. Сильд с соавт., (1959). Балластный осадок удаляют центрифугированием или сепарированием, а прозрачную жидкость подщелачивают до pH 7,0, добавляют 0,8% хлористого натрия и подвергают стерилизующей фильтрации.
Большое значение в рационализации технологии имела разработка и оснащение специализированной аппаратурой процесса очистки и концентрации сывороток (А. В. Бейлинсон, 1954; 1957; 1959; 1965; А. В. Бейлинсон, с соавт., 1955; Г. С. Безверхий, 1956). 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
116
117
118
119
120
121
122
123
124
125
126
127
128
129
130
131
132
133
134
135
136
137
138
139
140
141
142
143
144
145
146
147
148
149
150
151
152
153
154
155
156
157
158
159
160
161
162
163
164
165
166
167
168
169
170
171
172
173
174
175
176
177
178
179
180
181
182
183
184
185
186
187
188
189
190
191
192
193
194
195
196
197
198
199
200
201
202
|