Исследования в области особоопасных инфекций

Метод Диаферм-3

A. Harms (1948) указывает на преимущество работы с плазмой по сравнению с цельной кровью, сывороткой или с высоленными фракциями плазмы. По его схеме ферментация проводится при разведенной плазме 1:3 в течение 30 минут при pH 3,2 и температуре 30°, тепловая денатурация — при 55° в присутствии сернокислого аммония и трикрезола.

По G. Amoureux, F. Уеих (1951), фракция сыворотки разводится 1:1 и ферментируется при 31,5° и реакции среды 3,2 в течение 30 минут, термокоагуляция осуществляется при 55—57° в присутствии 14% сернокислого аммония и раствора толуола.

В 1953 г. в институте Пастера видоизменили схему и предложили сыворотку разводить в 2,33 раза, ферментацию проводить при pH 3,1—3,2 в течение 1 часа, термокоагуляцию — при 58° в течение 45 минут. В Советском Союзе ферментацию белков сыворотки с целью очистки и концентрации впервые применила С. М. Сосина (1942). Она предложила ее как дополнительную очистку к солевому методу.

А. Д. Адо (1943) использовал для переваривания белков антитоксической сыворотки поджелудочный сок собаки. Он показал, что ферментолиз повышает удельную активность препарата.

В 1943 г. А. В. Маркович и И. М. Хаустова отметили, что пепсин в больших дозах оказывает защитное действие в кислой среде на антитоксин противодифтерийной сыворотки.

Следует отметить, что в период Великой Отечественной войны и первые послевоенные годы антитоксические сыворотки в Советском Союзе выпускались в нативном и очищенном методами фракционирования нейтральными солями виде.

Технологическую схему очистки и концентрации антитоксических сывороток с помощью ферментолиза создал авторский коллектив во главе с А. В. Бейлинсон (1954). Были предложены последовательно 3 схемы очистки антитоксических сывороток, включающих ферментолиз, термоденатурацию балластных белков и диализ — Диаферм. Последняя модификация метода Диаферм-3 ИЭМ АМН СССР широко применяется во всех сывороточных производствах нашей страны. При очистке этим методом ферментация белков сыворотки ведется 2 часа при температуре 23° и pH среды 3,2 и 4,2 высокоактивным ферментом.

Балластные вещества удаляются с осадком при pH 4,3 прогреванием ферментированных сывороток 45 минут при 58° в присутствии 14%-сернокислого аммония.

Ферментированный иммунный глобулин выделяется из фильтрата при pH 7,0—7,1 дополнительным высаливанием сернокислым аммонием из расчета 200 г на 1 л фильтрата. Выпавший при этих условиях осадок иммунного глобулина отфильтровывается, прессуется и подвергается диализу проточной водопроводной водой.

Для последующей очистки ферментированных белков в сыворотку добавляют хлороформ и соляную кислоту до pH 5,0—5,3.

Еще в 1945 г. А. В. Бейлинсон с соавт. отметила, чго сыворотки, полученные после обработки пепсином, отличаются значительной вязкостью. Для освобождения от последней авторы применили изоэлектрическое осаждение денатурированных продуктов протеолиза при наличии в среде тонко эмульгированного хлороформа. Добавление в сыворотку после диализа 30% по объему хлороформа и энергичное встряхивание приводит в процессе осторожного и медленного подкисления к получению стабильной эмульсии хлороформа с желатинированными частицами белка, загрязняющего концентрированную сыворотку и сообщающего ей повышенную вязкость. После стояния на холоде эмульсия хлороформа в сыворотке разрушается, а желатинированные белки продолжают прочно удерживать хлороформ, погружаясь вместе с ним на дно, где образуют плотный осадок. Дополнительная очистка демонстративно видна на фореграммах. В сыворотке после диализа содержится 3 фракции белков, находящихся в зоне гамма-, бета-, и альфа-глобулинов. Дополнительная обработка ее хлороформом с последующим изоосаждением при вышеуказанном pH ведет к исчезновению фракции, лежащей в зоне альфа-глобулина, при этом оседает до 65% из противостолбнячной, до 50% — из противодифтерийной сывороток липопротеидов (А. И. Михайлов, с соавт., 1958).

На наличие 3 фракций в пептолизатах указывают также И. Я. Сильд с соавт., (1959). Балластный осадок удаляют центрифугированием или сепарированием, а прозрачную жидкость подщелачивают до pH 7,0, добавляют 0,8% хлористого натрия и подвергают стерилизующей фильтрации.

Большое значение в рационализации технологии имела разработка и оснащение специализированной аппаратурой процесса очистки и концентрации сывороток (А. В. Бейлинсон, 1954; 1957; 1959; 1965; А. В. Бейлинсон, с соавт., 1955; Г. С. Безверхий, 1956).

1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  15  16  17  18  19  20  21  22  23  24  25  26  27  28  29  30  31  32  33  34  35  36  37  38  39  40  41  42  43  44  45  46  47  48  49  50  51  52  53  54  55  56  57  58  59  60  61  62  63  64  65  66  67  68  69  70  71  72  73  74  75  76  77  78  79  80  81  82  83  84  85  86  87  88  89  90  91  92  93  94  95  96  97  98  99  100  101  102  103  104  105  106  107  108  109  110  111  112  113  114  115  116  117  118  119  120  121  122  123  124  125  126  127  128  129  130  131  132  133  134  135  136  137  138  139  140  141  142  143  144  145  146  147  148  149  150  151  152  153  154  155  156  157  158  159  160  161  162  163  164  165  166  167  168  169  170  171  172  173  174  175  176  177  178  179  180  181  182  183  184  185  186  187  188  189  190  191  192  193  194  195  196  197  198  199  200  201  202