Схема метода Ультраферм
Схема метода Ультраферм
Осаждение фибриногена, основной массы альбумина и эйглобулина риванолом (1 V плазмы+0,5V H20+0,5V р-ра риванола 1,2%, выдерживают при 2—8° 1—3 суток)
Протеолиз 1 ч при pH 3,2—3,22; 1 ч при 3,76—3,8
Сорбирование риванола и балластных белков при разведении ферментата 1/3 V H20 активированным углем и гидроокисью алюминия
Центрифугирование
Осадок балластных белков отбрасывается Стерилизующая фильтрация иммунного глобулина
Ультрафильтрация иммунного глобулина
Стандартизация
Стерилизующая фильтрация
Все перечисленные выше способы очистки и концентрации антитоксических сывороток являются неспецифическими.
Перспективным является применение специфических методов, позволяющих получить высокоочищенные антитела.
В этом плане следует остановиться на выделении антител с помощью специфической иммуносорбции, основанной на иммунологической реакции антиген-антитело. Схематически выделение антител этим методом можно представить поэтапно в следующем виде:
1. Образование нерастворимого комплекса антиген-антитело.
2. Отделение полученного комплекса от остальных пассивных белков сыворотки.
3. Диссоциация комплекса в условиях, обеспечивающих максимальное сохранение антител.
4. Отделение антител от антигена.
Предлагались различные иммуносорбенты. Большой удачей было получение нерастворимых иммуносорбентов, когда растворимый антиген соединяется с нерастворимым сорбентом и образуется нерастворимый иммуносорбент.
Одними из первых применили такой иммуносорбент L. Sternberger и D. Pressman (1950), в дальнейшем А. Е. Гурвич, Р. С. Незлин (1958), А. Е. Гурвич с соавт. (1961), К. Л. Шаханина (1964), М. В. Далин, Т. С. Котова (1966), В. Б. Фрейман, Н. У. Мерцалова (1968). Они использовали с этой целью дериваты целлюлозы. Последние сложны и трудоемки при приготовлении.
Boszormenyi (1958), И. И. Райхер (1966, 1968, 1973) в качестве инертной основы применили гель гидроокиси алюминия. Разработанная И. И. Райхером (1973) схема выделения чистых антител из противодифтерийной сыворотки, подвергнутой пептическому перевару, представлена на ст. 148.
При таком методе очистки автор получал до 60% антитоксина (по отношению к ферментированному материалу, из которого извлекали антитела), большую удельную активность препарата.
Интересна очистка гипериммунных сывороток методом протеолиза-сорбции В. И. Трубицина, 1974.
Схема метода выделения противодифтерийных антител с помощью специфической иммуносорбции
Ферментолиз 1 ч при pH 3,2, t 23°
Термоденатурация в присутствии 14% (NH4)2SO4 при 56° 45 мин.
Фильтрация
Осадок балластного белка отбрасывают В фильтрат с pH 6,8—7,0 добавляется иммуносорбент
Центрифугирование
Фильтрат отбрасывается Осадок: комплекс гель-анатоксин-антитоксин. Отделение ферментированных дифтерийных антител 1%-ным р-ром NaCl с pH 2,9—3,0
Центрифугирование
Осадок — освобожденный им фильтрат — ферментирован - иммуносорбентные дифтерийные антитела
Особенностью этого метода явилось исключение из технологического процесса термоденатурации и применение для сорбции балластных веществ безвредных высокоактивных сорбентов (гель гидроокиси алюминия и трифосфата кальция) в момент их образования.
По данным автора, применение этого метода увеличивает выход антитоксина на 6—15% и нагрузку, антител на 0,1 г белка по сравнению с методом Диаферм-3.
Схема очистки методом протеолиза — сорбции
Ферментативный гидролиз сывороточных белков пепсином (плазма, сыворотка разводятся до 3% белка) 1 ч при pH 3,25—3,33 и t 25—26° в присутствии 1,5—1,7% алюмокалиевых квасцов
Образование геля гидроокиси алюминия при подщелачивании ферментированного материала до pH 6,0, выдержка при 45° в течение 1 ч
Отделение осадка сорбента фильтрацией (осадок выбрасывается)
Высаливание иммунных глобулинов из активного фильтрата сульфатом аммония — 320 г/л
Отделение осадка глобулинов фильтрацией, прессование, диализ осадка против проточной воды в течение 48 ч
Дополнительная очистка диализата от остаточных балластных продуктов протеолиза и возможного пирогена с сорбентами, удаление ионов солей с помощью ионитов КУ-2 и ЭДЭ-10п, стерилизующая фильтрация
Обобщая литературные данные, следует еще раз подчеркнуть, что основным методом очистки и концентрации антитоксических сывороток является обработка их с включением пептического перевара. В сывороточных производствах до настоящего времени используют метод Диаферм-3, усовершенствованный и дополненный многими авторами, на исследованиях которых мы остановились выше. Указанный выше метод Просдис-2 пока еще не вошел в практику производства очищенных и концентрированных сывороток из-за большой длительности процесса ферментолиза, способствующего особенно в жаркий период возникновению пирогена.
Метод Ультраферм нуждается в техническом оформлении.
Выделение антител при помощи иммуносорбции пока еще имеет ограниченное применение, не связанное с производством лечебно-профилактических сывороточных препаратов. 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
116
117
118
119
120
121
122
123
124
125
126
127
128
129
130
131
132
133
134
135
136
137
138
139
140
141
142
143
144
145
146
147
148
149
150
151
152
153
154
155
156
157
158
159
160
161
162
163
164
165
166
167
168
169
170
171
172
173
174
175
176
177
178
179
180
181
182
183
184
185
186
187
188
189
190
191
192
193
194
195
196
197
198
199
200
201
202
|