Исследования в области особоопасных инфекций

Схема метода Ультраферм

Схема метода Ультраферм

Осаждение фибриногена, основной массы альбумина и эйглобулина риванолом (1 V плазмы+0,5V H20+0,5V р-ра риванола 1,2%, выдерживают при 2—8° 1—3 суток)
Протеолиз 1 ч при pH 3,2—3,22; 1 ч при 3,76—3,8
Сорбирование риванола и балластных белков при разведении ферментата 1/3 V H20 активированным углем и гидроокисью алюминия
Центрифугирование
Осадок балластных белков отбрасывается Стерилизующая фильтрация иммунного глобулина
Ультрафильтрация иммунного глобулина
Стандартизация
Стерилизующая фильтрация

Все перечисленные выше способы очистки и концентрации антитоксических сывороток являются неспецифическими.

Перспективным является применение специфических методов, позволяющих получить высокоочищенные антитела.

В этом плане следует остановиться на выделении антител с помощью специфической иммуносорбции, основанной на иммунологической реакции антиген-антитело. Схематически выделение антител этим методом можно представить поэтапно в следующем виде:

1. Образование нерастворимого комплекса антиген-антитело.
2. Отделение полученного комплекса от остальных пассивных белков сыворотки.
3. Диссоциация комплекса в условиях, обеспечивающих максимальное сохранение антител.
4. Отделение антител от антигена.

Предлагались различные иммуносорбенты. Большой удачей было получение нерастворимых иммуносорбентов, когда растворимый антиген соединяется с нерастворимым сорбентом и образуется нерастворимый иммуносорбент.

Одними из первых применили такой иммуносорбент L. Sternberger и D. Pressman (1950), в дальнейшем А. Е. Гурвич, Р. С. Незлин (1958), А. Е. Гурвич с соавт. (1961), К. Л. Шаханина (1964), М. В. Далин, Т. С. Котова (1966), В. Б. Фрейман, Н. У. Мерцалова (1968). Они использовали с этой целью дериваты целлюлозы. Последние сложны и трудоемки при приготовлении.

Boszormenyi (1958), И. И. Райхер (1966, 1968, 1973) в качестве инертной основы применили гель гидроокиси алюминия. Разработанная И. И. Райхером (1973) схема выделения чистых антител из противодифтерийной сыворотки, подвергнутой пептическому перевару, представлена на ст. 148. При таком методе очистки автор получал до 60% антитоксина (по отношению к ферментированному материалу, из которого извлекали антитела), большую удельную активность препарата.

Интересна очистка гипериммунных сывороток методом протеолиза-сорбции В. И. Трубицина, 1974.

Схема метода выделения противодифтерийных антител с помощью специфической иммуносорбции

Ферментолиз 1 ч при pH 3,2, t 23°
Термоденатурация в присутствии 14% (NH4)2SO4 при 56° 45 мин.
Фильтрация
Осадок балластного белка отбрасывают В фильтрат с pH 6,8—7,0 добавляется иммуносорбент
Центрифугирование
Фильтрат отбрасывается Осадок: комплекс гель-анатоксин-антитоксин. Отделение ферментированных дифтерийных антител 1%-ным р-ром NaCl с pH 2,9—3,0
Центрифугирование
Осадок — освобожденный им фильтрат — ферментирован - иммуносорбентные дифтерийные антитела

Особенностью этого метода явилось исключение из технологического процесса термоденатурации и применение для сорбции балластных веществ безвредных высокоактивных сорбентов (гель гидроокиси алюминия и трифосфата кальция) в момент их образования. По данным автора, применение этого метода увеличивает выход антитоксина на 6—15% и нагрузку, антител на 0,1 г белка по сравнению с методом Диаферм-3.

Схема очистки методом протеолиза — сорбции

Ферментативный гидролиз сывороточных белков пепсином (плазма, сыворотка разводятся до 3% белка) 1 ч при pH 3,25—3,33 и t 25—26° в присутствии 1,5—1,7% алюмокалиевых квасцов
Образование геля гидроокиси алюминия при подщелачивании ферментированного материала до pH 6,0, выдержка при 45° в течение 1 ч
Отделение осадка сорбента фильтрацией (осадок выбрасывается)
Высаливание иммунных глобулинов из активного фильтрата сульфатом аммония — 320 г/л
Отделение осадка глобулинов фильтрацией, прессование, диализ осадка против проточной воды в течение 48 ч
Дополнительная очистка диализата от остаточных балластных продуктов протеолиза и возможного пирогена с сорбентами, удаление ионов солей с помощью ионитов КУ-2 и ЭДЭ-10п, стерилизующая фильтрация

Обобщая литературные данные, следует еще раз подчеркнуть, что основным методом очистки и концентрации антитоксических сывороток является обработка их с включением пептического перевара. В сывороточных производствах до настоящего времени используют метод Диаферм-3, усовершенствованный и дополненный многими авторами, на исследованиях которых мы остановились выше. Указанный выше метод Просдис-2 пока еще не вошел в практику производства очищенных и концентрированных сывороток из-за большой длительности процесса ферментолиза, способствующего особенно в жаркий период возникновению пирогена.

Метод Ультраферм нуждается в техническом оформлении.

Выделение антител при помощи иммуносорбции пока еще имеет ограниченное применение, не связанное с производством лечебно-профилактических сывороточных препаратов.

1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  15  16  17  18  19  20  21  22  23  24  25  26  27  28  29  30  31  32  33  34  35  36  37  38  39  40  41  42  43  44  45  46  47  48  49  50  51  52  53  54  55  56  57  58  59  60  61  62  63  64  65  66  67  68  69  70  71  72  73  74  75  76  77  78  79  80  81  82  83  84  85  86  87  88  89  90  91  92  93  94  95  96  97  98  99  100  101  102  103  104  105  106  107  108  109  110  111  112  113  114  115  116  117  118  119  120  121  122  123  124  125  126  127  128  129  130  131  132  133  134  135  136  137  138  139  140  141  142  143  144  145  146  147  148  149  150  151  152  153  154  155  156  157  158  159  160  161  162  163  164  165  166  167  168  169  170  171  172  173  174  175  176  177  178  179  180  181  182  183  184  185  186  187  188  189  190  191  192  193  194  195  196  197  198  199  200  201  202