|
Схема метода Диаферм-3
Реакторы, кассетные фильтры, сепараторы и другие заменили бачки, стаканчиковые центрифуги, воронки.
При очистке и концентрации антитоксических сывороток методом Диаферм-3 количество антитоксина на 1 г белка повышается в 3,8 раза, титр увеличивается в 6—8 раз при содержании белка до 20% (А. В. Бейлинсон, 1959), выход антитоксина составляет 50% (И. С. Базилевская с соавт., 1955).
Следует отметить, что наибольшие потери антитоксина приходятся на первый час ферментации — 31—47% (И. Л. Теодорович, с соавт., 1956). И. Я. Сильд (1956) наблюдал до 41% потерь. По данным А. В. Бейлинсон с соавт. (1958), на I стадии очистки по противодифтерийной сыворотке отмечается 25% потери антитоксина, по противостолбнячной — 32%, при термоденатурации — 8—14%.
На потери антитоксина оказывают влияние многие факторы, в том числе длительность эксплуатации продуцентов.
Наибольший выход 3. И. Сосина и Л. Н. Изумрудова (1957) наблюдали у лошадей-продуцентов противодифтерийной сыворотки со средней длительностью эксплуатации.
По данным А. В. Бейлинсон с соавт. (1964), потери антитоксина в обрабатываемой противостолбнячной сыворотке от 1-го цикла составляют 67%, после 10-го цикла — 20%. Особенно большие потери в гамма-фракции — до 40%. На это же указывают В. Н. Мирскова с соавт. (1967).
По данным А. И. Михайлова с соавт. (1958), на отдельных этапах очистки и концентрации сывороток по методу Диаферм-3 потери антитоксина колеблются в пределах 10—15%. Общие потери для противостолбнячной и противодифтерийной сывороток составляют в среднем 60% при удалении от 83,7 до 85,6% белка и увеличении нагрузки на 1 г белка от 2,4 до 2,9%.
Схема метода Диаферм-3
I стадия
Сыворотка разводится до 3% белка
Ферментолиз при 23° 1 ч при pH - 3,2; 1 ч при pH - 4,2
Термоденатурация (добавление 14% (NH4)2S04 и прогревание при pH 4,3, 58° 45 мин.)
Фильтрация
II стадия
Осадок отбрасывается Высаливание иммунного глобулина: в фильтрат с pH 7,0—7,1 добавляется до 34%-ной концентрации NH4)2S04
Фильтрация
Фильтрат отбрасывается. Осадок иммунного глобулина прессуется
Диализ иммунного глобулина до 0,2% (NH4)2S04
III стадия
Освобождение антитоксина от балластного белка хлороформом и подкислением НСl.
Сепарирование
Осадок балластного белка и хлороформ отбрасываются.
Стандартизация раствора антитоксина до 0,85% NaCl и pH 6,8—7,0
Стерилизующая фильтрация
Сыворотки, очищенные методом протеолиза, обладают сниженными антигенными, анафилактогенными свойствами (A. Weil, I. Parfentjev, К. Bowman, 1938; С. И. Диденко, Ф. А. Черткова, 1951; Ш. Л. Деречинская, Е. Я. Ермакова, 1948; Н. А. Курочкина, 1952; Ф. А. Черткова, Т. В. Шаповалова, 1952; А. А. Ушакова, 1952; Л. С. Базилевская с соавт., 1955; Г. Г. Зиннаск, А. А. Шарашкина, 1959;
А. А. Колчурина, 1959; Г. К. Христова, 1962; Г. П. Петрова, Н. И. Криводубская, 1962), хорошими резорбционными (Л. С. Базилевская с соавт., 1955). Повышается у большинства серий сила авидитета (В. Б. Фрейман, 1958). Однако Ф. А. Черткова с соавт. (1952, 1962) указывают, что аллергенные свойства в таких сыворотках все еще значительны.
По электрофоретической подвижности они сравнительно однородны. Основное количество белков таких сывороток совпадает с гамма-, бета-глобулинами нативных сывороток (G. Amoureux, F. Уеа, 1951; Н. А. Пономарева с соавт., 1956; В.Н. Мирскова с соавт., 1957; А. А. Шарашкина, 1959).
Изучение длительности нахождения их в организме показало, что они уже на 6-й день в значительной степени выводятся (Ф. А. Черткова, И. JI. Плетнева, 1952). Титр антител держится на сравнительно высоком уровне в течение 3 суток (Н. X. Музафарова, Г. Е. Синельников, С. М. Прегер, 1973).
Метод Диаферм-3 ИЭМ АМН СССР получил всеобщее признание, он был также внедрен в сывороточное производство Болгарии и Чехословакии.
На протяжении длительного применения данного метода детально изучили все стадии процесса и выявили, что наряду с достоинствами метод имеет ряд существенных недостатков, одним из которых является возможность возникновения пирогена в связи с проведением процесса в открытых условиях. Применение пирогенных серий сывороток вызывало у привитых тяжелейшие реакции, характерные для бактерийных пирогенов, сопровождающиеся резким повышением температуры, ознобом, цианозом, судорогами, снижением кровяного давления.
В 1956 г., по инициативе ГИСК им. Л. А. Тарасовича, был изучен вопрос о наличии в сыворотках пирогена и введен контроль на выявление его (Ф. А. Черткова, Т. В. Шаповалова, 1962).
Основной причиной возникновения пирогена в сыворотках является обсеменение их микробами на этапах концентрации (Т. В. Шаповалова, 1952; Г. Христова с соавт., 1960 и др.).
Самой продолжительной стадией при очистке и наиболее благоприятной для обсеменения материала микрофлорой и возникновения в сыворотке пирогена является диализ (Л. И. Райхер, 1954; Т. А. Витохина, 1965 и др.). 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
116
117
118
119
120
121
122
123
124
125
126
127
128
129
130
131
132
133
134
135
136
137
138
139
140
141
142
143
144
145
146
147
148
149
150
151
152
153
154
155
156
157
158
159
160
161
162
163
164
165
166
167
168
169
170
171
172
173
174
175
176
177
178
179
180
181
182
183
184
185
186
187
188
189
190
191
192
193
194
195
196
197
198
199
200
201
202
|