Исследования в области особоопасных инфекций

Дифтерия. К. П. Илларионова

К вопросу определения токсигенных свойств дифтерийных бактерий

аблица 1. Реакция преципитации в агаре у штаммов С. diphtheriae и формы заболевания, при которых они выделены

Оухтерлони (1948—1949) и Илек (1948—1949) предложили новый метод определения токсигенности у С. dipfttheriae на плотной питательной среде, основанный на реакции преципитации между токсином и антитоксином. Ряд отечественных исследователей (Н. И. Волович, М. М. Лейкина, Г. В. Романов и А. Н. Шнеерсон, Э. 3. Рахман, А. С. Круткова и др.) внес в этот метод некоторые изменения, упрощающие рецепты сред, благодаря чему он получил широкое распространение.

Достоверность метода реакции преципитации в агаре изучалась при помощи сопоставления его с результатами испытания токсигенности in vivo (внутрикожным и подкожным введением морской свинке культуры дифтерийной палочки).

В настоящее время имеется достаточно материала по сравнительному изучению токсигенности дифтерийных бактерий двумя методами — in vitro и in vivo. Так, например, Илек (1948), Оухтерлони, Кинг, Фробишер, Парсонс (1949), Марисова (1954), В. С. Суслова (1956) получили совпадение результатов в 100% случаев, Бедер (1952) — в 83%, Кравченко (1955) — в 87%, Н. И. Волович и М. М. Лейкина (1956) — в 97%. Авторы отмечают, что метод определения токсигенности на плотных средах является высокочувствительным и поэтому в части случаев выявляет слабую токсигенность штамма, которая не всегда обнаруживается при внутрикожном введении морской свинке. При постановке реакции преципитации линии преципитата появляются в различные сроки. И. К. Джаврова (1957) предлагает использовать этот признак для определения степени токсигенности штаммов, что было бы интересно как теоретически, так и. практически.

Жидкая питательная среда создает более оптимальные условия для токсинообразования у С. diphtheria что позволяет произвести количественный анализ образующегося в ней дифтерийного токсина. Нам казалось небезынтересным проверить токсигенность штаммов в бульонных культурах и сопоставить полученные данные с результатами проверки этих свойств методом in vitro на плотной среде.

Этими двумя методами изучались выделенные в 1958 г. штаммы от 40 больных дифтерией и от четырех бактерионосителей, находившихся на стационарном лечении в клинике медицинского института и инфекционной больнице № I гор. Ташкента. Благодаря содействию зав. лабораторией Ф. М. Подуровской и зав. лабораторией Р. Я. Осатиловской отбирались положительные посевы от больных на первый или второй день их госпитализации.

Токсигенность штаммов мы начинали изучать после идентификации их по биохимическим и культуральным свойствам. В девяти случаях штаммы были выделены от больных с токсической формой дифтерии, в пяти — с тяжелой формой, в 22 — с заболеванием средней тяжести, в четырех — с легкой формой; и четыре, штамма — от бактерионосителей.

Для проверки токсигенности на плотной среде мы использовали вариант, предложенный Н. И. Воловичем и М. М. Дейкиной (1956), Применив агар, приготовленный на бульоне Мартена с 0,3%. мальтозы и 0,003 % цистина, pH среды — 7,8. Перед употреблением к среде добавлялось 20%. лошадиной сыворотки (без консерванта). Все опыты по определению токсигенности в агаре проводились с одной серией и дифтерийной антитоксической сыворотки «Диаферм-III», изготовленной ТашНИИВС (серия № 20, титр 2300 АЕ в 1 мл). Для опыта сыворотка разводилась до содержания 500 АЕ в 1 мл. Испытуемые штаммы в количестве 3—4 и один заведомо токсигенный (штамм — РВ8 или 864, 865) одновременно засевались на две чашки.

При учете результатов в некоторых случаях, отмечалось отсутствие реакции преципитации у заведомо токсигенного штамма на одной из засеянных чашек. При повторной проверке мы установили, что для диффузии антигена и антитоксина необходимо равномерно распределять агар, что может нарушаться при неровном (выпуклом) дне чашки. Посевы выдерживались четверо суток в термостате, а затем — при комнатной температуре до, десятого дня. В положительных случаях линии преципитации в виде нежных стрел-«усиков» обычно появлялись после 24 часов и в редких случаях через 18—20 часов. Если преципитат не появлялся к 3—4 суткам, то позднее он не возникал.

Из рис. 1 видно, что при положительной реакции линии преципитата соединяются между собой дугообразно. В тех случаях, когда между штрихами посевов токсигенных штаммов находится штрих, нетоксигенного штамма, образующиеся линии преципитации также дугообразно соединяются между собой, пересекая штрих нетоксигенной, культуры.

При испытании 44 штаммов дифтерии 35 дали положительную реакцию преципитации в агаре (табл.1)

При определении токсигенности на плотной среде сроки появления реакции преципитации уштаммов были различные и не зависили от формы заболевания, при которых они были выделены. Проводить какие-либо параллели в этом мы не считаем возможным, так как при повторной проверке мы иногда наблюдали замедление или ускорение сроков появления преципитации у одного и того же штамма.

Активность токсинообразования у тех же штаммов мы определяли на жидкой питательной среде (бульон Мартена с 0,2% глюкозы и 0,5% ацетата натрия при pH — 8,0—8,2). После 8-9 суток инкубации при 34-35 град. токсичность фильтратов бульонных культур испытывалась на морских свинках, предварительно отобранных по реакции Шика. Каждой морской свинке внутрикожно вводились разведения испытуемого фильтрата (1/10. 1 1/100, 1500, 1/1000, 1 5000, 1/10000, 1/50000, 1/100000) в объеме 0,1 мл.

Положительный результат испытания токсичности оценивался минимальным количеством токсина, которое вызвало у морской свинки на месте инъекции реакцию в виде некроза или инфильтрата. Контролем качества питательной среды являлся фильтрат штамма РW8, полученный в тех же условиях.

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20   21   22   23   24   25   26   27   28   29   30   31   32   33   34   35   36   37   38   39   40   41   42   43   44   45   46   47   48   49   50   51   52   53   54   55   56   57   58   59   60   61   62   63   64   65   66   67   68   69   70   71   72   73   74   75   76   77   78   79   80   81   82   83   84   85   86   87   88   89   90   91   92   93   94   95   96   97   98   99   100   101   102   103   104   105   106   107   108   109   110   111   112   113   114   115   116   117   118   119