Режим стерилизации жидкой питательной среды в глубинном производстве кишечных вакцин
В настоящее время при изготовлении кишечных вакцин бактерии выращиваются глубинным способом. Выращивание обычно ведется в реакторах-котлах большого объема, куда помещается и жидкая питательная среда в количестве от 150 литров до 500 и более. Большой объем питательной среды усложняет ее стерилизацию. Поэтому необходимо найти такой способ, при котором можно простерилизовать среду и в то же время сохранить ее питательные качества, необходимые для размножения бактерий.
В своих исследованиях мы применили два вида стерилизации больших объемов питательной среды: горячую стерилизацию паром и холодную стерилизацию фильтрованием через стерилизующие пластинки фильтра Сальникова.
Горячая стерилизация производилась пропусканием пара в рубашку герметически закрытого котла с питательной средой, чем достигалась определенная температура среды.
Изучался следующий режим горячей стерилизации: при 120° — 15 мин., при 115°— 30 мин., при 110° — 30 мин., при 105° — 60 мин., при 100 — 60 мин. Продолжительность всей стерилизации, начиная от температуры в 100° до конца процесса, обычно составляла 1,5—2 часа, включая время стерилизации при намеченной температуре.
Опыты проводились в производственных условиях в двух равноценных реакторах емкостью по 250 литров. Испытывались объемы сред от 150 До 200 л и выращивались только бактерии Флекснера. Применялись следующие питательные среды: бульон из Казеинового гидролизата, бульон из смеси казеинового гидролизата и 40% дрожжевого аутолизата.
Казеиновый бульон готовился так: казеиновый гидролизат триптического переваривания, предварительно простерилизованный впрок при 0,5 атм. 20 минут, фильтровался через вату и разводился водопроводной водой из расчета содержания в готовом бульоне 250 мг/% аминного азота. К нему добавлялся хлористый натрий в количестве 0,5% до рН=7,6—7,8. Затем в пароварочном котле этот бульон варился при температуре 98-100° и горячий фильтровался через фильтровальное полотно. После фильтрования бульон заливался в реактор и стерилизовался при заданной в опыте температуре.
Бульон из смеси казеинового бульона и дрожжевого аутолизата готовился из обычного казеинового пептона, к которому добавлялся аутолизат в количестве 40%. Дрожжевой аутолизат приготовлялся следующим образом: пивные дрожжи наливались в бутыли и ставились на 48 часов в водяную баню при 50° для аутолиза дрожжевых клеток. Верхний слой аутолизата декантировался от дрожжевых клеток и стерилизовался впрок при 0,5 атм, 20 мин. Этот дрожжевой лизат добавлялся к казеиновому бульону из расчета содержания в нем 250 мг/% аминного азота. Затем бульон варился в пароварочном котле, фильтровался, переливался в реактор и стерилизовался при намеченной в опытах температуре. По окончании стерилизации производился так называемый «монтаж» котла при температуре в 100° С.
«Монтаж» котла имеет большое значение для обеспечения стерильности питательной среды. Он заключается в подсоединении к котлу шлангов для подачи и удаления воздуха и опускании в широкий люк котла сифонов, укрепленных на пластине из нержавеющей стали. Через эти сифоны производится в дальнейшем засев посевного материала в котел, добавление глюкозы и выемка проб в процессе выращивания. Вставлять пластину с сифонами необходимо при температуре не ниже 100° С, иначе в котел может засосаться наружный воздух, который нарушит стерильность питательной среды.
Для сохранения стерильности питательной среды полностью обеспечивалась стерильность воздуха, подаваемого в реактор при выращивании. Воздух подавался воздушным компрессором сначала в специальный ватно-угольный воздушный фильтр, который стерилизовался паром, подававшимся в его рубашку. Из воздушного фильтра по шлангу воздух проходил в реактор, причем по ходу шланга вставлялся ватный фильтр (полый цилиндр из нержавеющей стали, заполненный ватой и простерилизованный в автоклаве).
Проделанная работа показала, что все применявшиеся варианты режима горячей стерилизации полностью обеспечивают стерильность среды. Режим стерилизации не изменял содержания аминного азота в питательной среде и не отражался на конечном урожае выращиваемых бактерий.
Густота выращенной микробной взвеси при различном режиме стерилизации равнялась 21—31 млрд, микробных тел в 1 мл. Однако наиболее густая микробная взвесь получалась при стерилизации среды в течение 30 минут при 115°, при этом густота микробной взвеси в среднем была равна 31 млрд. в 1 мл, а в смеси казеинового бульона с дрожжевым аутолизатом — 27,5 млрд. При других режимах стерилизации густота микробной взвеси составляла от 24 до 26 млрд в 1 мл при выращивании в казеиновом бульоне и от 19 до 23 млрд. в 1 мл при выращивании в смеси казеинового бульона с дрожжевым лизатом. С чистым дрожжевым аутолизатом опыты проводились только при двух вариантах режима стерилизации при 105° С — 60 мин. и при 100°С - 60 мин. В данном случае густота выращенной микробной взвеси была от 19 до 29 млрд. в 1 мл.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
116
117
118
119
|