Исследования в области особоопасных инфекций

Методы определения токсигенности (in vivo и in vitro)

В настоящее время существует несколько методов определения токсигенности (in vivo и in vitro), из которых далеко не все применяют на практике. Наибольшее распространение получил внутрикожный метод определения патогенности микробов дифтерии на морских свинках или кроликах. На 2—3-й день после внутрикожного введения вирулентной культуры С. diphtheriae наблюдают воспалительный инфильтрат с последующим некрозом кожи. У морских свинок и кроликов, защищенных антитоксической сывороткой, эти явления отсутствуют. На морских свинках и кроликах можно также титровать дифтерийный токсин (определять Dlm, Dcl, ID50). Метод долгое время применяли в лабораториях в качестве единственного для определения вирулентности С. diphtheriae.

Однако он длителен (не менее 4 сут), в коже дифтерийные бактерии в результате фагоцитоза могут быстро гибнуть и тогда реакция будет отрицательна даже у заведомо токсигенНой культуры. У некоторых штаммов токсигенные свойства выявляются только при введении больших доз. На результаты опыта может оказать влияние состояние организма морской свинки, например содержание в организме витамина С.

Выявление токсигенности и вирулентности С. diphtheriae на куриных эмбрионах по чувствительности намного превосходит метод внутрикожного титрования Dim на морских свинках и кроликах. Высокочувствительны к токсину 9-дневные куриные эмбрионы, они гибнут при введении в хорион-аллантоисную полость единиц и десятков микробных клеток токсигенной культуры и практически не чувствительны к нетоксигенным штаммам (Н. Н. Костюкова, Н. И: Блинова, 1967; М. Д. Крылова, М. А. Мнушкина, 1973; Budding, Henigst, I960, и др.).

В 1948 г. независимо друг от друга Elek и Ouchterlony описали методику определения токсигенности дифтерийных штаммов на чашках, которую стало возможно использовать в широкой практике.

Метод Elek и Ouchterlony получил высокую оценку исследователей в разных странах. Для выявления дифтерийного токсина пробы на куриных эмбрионах и чашечный метод оказались более чувствительны, чем внутрикожные пробы на морских свинках и кроликах (Г. Я. Свет-Молдавский, 1956; Э. 3. Рахман, 1957, 1958, 1964; King, 1949; см. М. Д. Крылова, 1972). За основу была взята методика Elek, которую авторы усовершенствовали в различных направлениях. С 1959 г. метод используют в СССР в практических лабораториях.

Широкое использование этого метода на практике позволило выявить возможность ошибок при определении токсигенности in vitro, которые бывают двух родов: «гиподиагностика», когда у токсигенных штаммов токсин не улавливают, и «гипердиагностика»» - когда нетоксигенные штаммы признают токсигенными.

«Гиподиагностика» может быть следствием слабого образования токсина в инокулюме ввиду плохого роста штаммов (нужен массивный засев), избыточного содержания железа в среде.

Токсигенность можно не выявить вследствие удаленности бляшек посева от бумаги с антитоксической сывороткой, отклонения pH, низкого качества среды (марка агара), чрезмерного подсыхания поверхности чашки, высокой концентрации агара в среде (затрудняет диффузию токсина и антисыворотки), концентрации антитоксина на бумаге и др.

Малые количества токсина могут сразу же разлагаться бактериальными протеазами на фрагменты, тогда на чашках будет не «главная» линия преципитации, а только линии, которые подчас невозможно отличить от «неспецифических» линий преципитации, образующихся с белками нетоксигенных штаммов (Libich, 1964).

Одной из причин «гипердиагностики» являются так называемые неспецифические (вторичные, или «ложные») линии преципитации. Они бывают как у токсигенных, так и у нетоксигенных штаммов. Elek (1948) объяснил их появление присутствием в сыворотке соответствующих антител и отличал вторичные линии от главных, образованных токсином. Главные линии появляются раньше; они сливаются друг с другом и не сливаются с неспецифическими («ложными»), давая с ними кросс-реакцию, которая позволяет отличить неспецифические «ложные» реакции преципитации от специфических «истинных» (Ouchterlony, 1949; King е. а., 1950).

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20   21   22   23   24   25   26   27   28   29   30   31   32   33   34   35   36   37   38   39   40   41   42   43   44   45   46   47   48   49   50   51   52   53   54   55   56